GENERACIÓN DE UN SISTEMA DE TRANSFORMACIÓN PARA LOS MUSGOS Bryum billarderi SCHWÄGR Y Pseudocrossidium replicatum (Taylor) R. H. ZANDER

Abstract

Los musgos B. billarderi and P. replicatum son especies de plastas que pueden tolerar la desecación, la salinidad y otros estreses abióticos. En este trabajo desarrollamos una estrategia para la transformación de estos musgos, con el propósito de desarrollar una tecnología que permita entender los mecanismos que les confieren esa tolerancia y explorar la oportunidad de producir proteínas recombinantes. Primero, generamos las condiciones para obtener y regenerar protoplastos a partir de tejido protonemal de ambas especies. En este punto, tuvimos que evaluar el efecto de diferentes concentraciones de driselasa (1, 2 y 3 %), tiempos de exposición (1, 1.5 y 2 horas) y la edad del protonema (5, 10 y 15 días) sobre el aislamiento y regeneración de los protoplastos únicamente de B. billarderi, debido a que tuvimos una gran variación en la cantidad de protoplastos obtenidos en esta especie (from 2.45 x 105 to 2.6 x 106 protoplastos ml-1) y en P. replicatum siempre obtuvimos una gran cantidad de protoplastos(from 2.05 x 106 to 2.54 x 107 protoplastos ml-1), por lo que no fue necesario realizar ese ensayo en este musgo. El mejor tratamiento para obtener protoplastos (5.35x106 protoplasts g-1) fue: 10 días de edad, 2 % de concentración y 2 horas de exposición; sin embargo, la mejor tasa de regeneración (72.08 %) fue encontrada en: edad 5 días, 2 % de concentración y 1 hora de exposición. Segundo, usamos el plásmido pPGX8 para transformar ambas especies de musgos y el musgo modelo P. patens para comparar nuestros resultados. Colonias resistentes al antibiótico transitorias fueron recuperadas en una alta eficiencia de transformación (82 colonias μg-1 DNA linearizado) en el musgo B. billarderi obteniendo aproximadamente 1640 colonias por evento de transformación; sin embargo, solo obtuvimos 2 colonias resistentes al antibiótico transitorias en el musgo P. replicatum. Comparativamente, obtuvimos menos colonias resistentes al antibiótico transitorias en P. patens (4.66 colonias μg-1 DNA linearizado) que en B. billarderi; sin embargo, sólo obtuvimos líneas estables en P. patens. El plásmido pPGX8 fue construido para transformar P. patens, debido a que posee regiones homologas al genoma de este musgo, quizá por esta razón no obtuvimos líneas estables en B. billarderi y P. replicatum. Tercero, generamos la construcción pPGX8::CD43 para explorar la producción de la proteína humana CD43 en las 10 tres especies de musgos. Obtuvimos clonas únicamente de B. billarderi y P. patens usando la construcción pPGX8::CD43, pero todas las clonas de B. billarderi murieron después de un periodo de tiempo; sin embargo, obtuvimos 10 clonas de P. patens, de las cuales 4 fueron analizadas mediante PCR obteniendo que en todos los casos fue observada una banda correspondiente a CD43.