Purificacion y caracterizacion parcial de la profenoloxidasa de hemocitos de camarón café (Penaues californiensis)

Abstract

En los invertebrados las reacciones de defensa casi siempre están acompañadas de melanización. La fenoloxidasa es la enzima que cataliza la reacción de síntesis del pigmento melanina. Esta enzima se encuentra en forma inactiva dentro de los gránulos de las células sanguíneas de los artrópodos (hemocitos) y es el componente principal de un complejo sistema de reconocimiento y defensa llamado sistema profenoloxidasa. La activación de este sistema puede ser inducida por componentes de la pared celular de bacterias y levaduras y provoca la liberación del contenido granular. Durante el proceso de activación de la profenoloxidasa interviene una proteasa que convierte a la profenoloxidasa en una enzima activa (fenoloxidasa) por medio de una proteólisis controlada. La profenoloxidasa ha sido aislada de crustáceos a partir de lisado de hemocitos, sin embargo en camarón solo se había demostrado su presencia y participación en la fagocitosis. En este trabajo se aisló la profenoloxidasa utilizando shock osmótico para inducir la degranulación de los hemocitos de camarón café (Penaeus californiensis) y se trabajo con el contenido granular. Para la purificación de la profenoloxidasa se probaron diferentes tipos de cromatografía en columna, obteniéndose los mejores resultados con cromatografía de afinidad. Además se demostró la participación del calcio en la activación de la profenoloxidasa a través de su proteasa activadora. La masa molecular obtenida por electroforesis en acrilamida en condiciones desnaturalizantes fue de 113.9 kDa para la profenoloxidasa y de 106.6 kDa para la fenoloxidasa. El punto isoeléctrico para ambas formas de la enzima fue de 7.35. Las dos formas de la enzima son sensibles a la temperatura presentando una inactivación al ser incubadas a temperaturas mayores de 40 °C. EL pH óptimo en la reacción de la fenoloxidasa fue de 8. La mayor afinidad de la fenoloxidasa fue por el sustrato l-dopa y el mayor porcentaje de inhibición fue ocasionado por el cobre y por el acido ditiocarbámico. Por las características cinéticas y de inhibición la forma activa de la enzima fue identificada como una tirosinasa (E.C. 1.14.18.1), parecida a la encontrada en langostino.