Análisis de los cambios estructurales de células in vitro de Tagetes erecta L. sometidas a biobalística

Abstract

Se usaron células de callo de Tagetes erecta L. (material porte “bajo”) como modelo para introducir por biobalística el gen lcy-β (de la ruta de carotenoides), para valorar la probable transformación estable y analizar los cambios morfológicos celulares provocados por la biobalística. Se extrajeron los plásmidos pBI426 y pC35Sβ de E. coli y se analizaron por restricción. Se hicieron ensayos de expresión transitoria bombardeando partículas de oro con pBI426, valorando tres presiones y tres distancias para determinar las condiciones de bombardeo en cámara de baja presión. Las condiciones 60psi/14.5 cm mostraron los valores más altos de expresión transitoria, las cuales se usaron para bombardear callo con la construcción pC35Sβ. Los callos bombardeados, a pesar de mostrar valores positivos de viabilidad celular (67%), no pudieron ser subcultivados. Esta característica se evaluó por tinción diferencial con los fluorocromos DAF y PI. Se ha reportado que la viabilidad celular no asegura que las células conserven la capacidad de desarrollar masa celular en subcultivos. Se analizaron micrografías de fluorescencia con tinción de IP para investigar los cambios en los núcleos de las células bombardeadas y no bombardeadas. Mediante Tratamiento Digital de Imágenes, se analizó la morfología de los núcleos, encontrando que la tendencia en los tamaños de área y perímetro del núcleo de las células bombardeadas fueron menores respecto a las no bombardeadas. Los núcleos presentaron diferencias morfológicas en la disposición y forma de la cromatina, en el transcurso de 22 días de cultivo. Las células bombardeadas mostraron cuerpos nucleares muy condensados en el nucleoplasma; no así en las células no bombardeadas; sin embargo no se pudo asegurar que los cambios morfológicos fueran resultado de callos transformados. Por otro lado, durante la captura de imágenes en fluorescencia, se observaron traqueidas en ambas líneas celulares (células de callo bombardeadas y no bombardeadas). Por MEB ambiental también se observó la presencia de células diferenciadas en los cultivos de callo de T. erecta, estas células diferenciadas en el callo se identificaron como traqueidas, en las cuales se ha reportado el engrosamiento de la pared celular y la síntesis de lignina. En la literatura no se encuentran reportes de estas estructuras para cultivos in vitro de T. erecta. Este modelo podría usarse para abundar en el estudio de la síntesis del xilema y de lignina, a nivel molecular y celular. Los elementos de tráquea se observaron tanto en callos bombardeados como en no bombardeados.