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Título : Obtención Purificación y Aplicación de Lunasin Recombinante
Autor : Dra. Silvente Kelle, Sonia Teresa
Dr. Fernández Muñoz, José Luís
M. en T. Gruintal Santos, Miguel Ángel
Palabras clave : Lunasin Recombinante
Fecha de publicación : 10-ene-2012
Resumen : Cancer is currently the second leading cause of death in the world average for the development of this work we propose to use a compound having anticancer activity as a preventative, so that a compound can be used as a preventative need not be toxic, have a broad spectrum of action, ie to protect against a variety of types of cancers and that is affordable so you can have an impact on different social classes. Lunasin was found in soybeans and is home to a greater amount is not toxic, it has proven anti-cancer activity in breast cancer, colon, prostate, leukemia and skin, therefore desidimosproponer the use of this peptide, but has the disadvantages is currently very expensive to obtain, such as a peptide loses about 95% during the digestive system, one option could be consumed directly as soybean seed is more contained, but still is in very small quantities and always be lost during digestion other drawback is that soy consumption in the global average is very low. For these reasons we propose to clone the DNA sequence of lunasin and transform E. coli overexpression system that allows us to obtain, during the process of protein expression were problems to get it and we realized that the problem is that the protein is too small, just 4.5 kDa, to solve this problem proposed to anchor the protein DHFR with digestion site for Factor Xa and thus obtain a free lunasin, the problems that arose were that because the basin is DHFR contains a 6xHis sequence which confers negative charge to the entire protein in a pH range from 6 to 7 and paragraphs acid sequence that has lunasin is negatively charged is a polymerization process making it impossible to obtain free lunasin for these reasons we decided to seek a new path, which was cloned lunasin protein with the same protease DHFR but with a cutting site for protease stateless which has the advantage that its activity is at acidic pH and its cost is very economical, we can correct the problem this way digestion brought new problems but the main one was that digests protein DHFR anchor producing a mixture which is very difficult to obtain a pure lunasin in order to solve this problem we propose to continue with the same protease apart because not digested lunasin and is very economical, for this would be necessary to use as spike protein lunasin ie construct a sequence containing a 3 copies of lunasin with cutting intermediate sites for aspartic protease to digest so that lunasin obtain sequences, the problem of purification of 6xHis sequence occurs dare to clone it would solve this sequence without purification of 6xHis and dare be held ion exchange resin, to solve the problem of loss due to digestion propose to use an enteric microcapsule lunasin let alone be released into the small intestine, as the digestion of proteins on this site still continues propose that lunasin is mixed with ascorbic acid as this would produce an acidic environment around the protease inhibiting lunasin they can to lunasin danto to even greater ability to remain intact Paraquad can cross the intestinal epithelium and finally reach the bloodstream in which otherwise could be used to lunasin is in skin creams because it has been shown to reduce the likelihood of skin cancer by up to 75% in this case could be micro-encapsulated in liposomes and thereby increase the likelihood of absorption.
Descripción : El cáncer en la actualidad representa la segunda causa de muerte en el promedio mundial, para el desarrollo de este trabajo proponemos utilizar un compuesto que tenga actividad ánticancerígena como preventivo, para que un compuesto pueda ser utilizado como preventivo necesitamos que no se toxico, que tenga un amplio espectro de acción, es decir que proteja contra una gran variedad de tipos de canceres y que sea de un costo accesible para que pueda tener un impacto a las diferentes clases sociales. Lunasina fue descubierto en semillas de soya y es donde se encuentra en mayor cantidad no es toxica, presenta actividad anticancerígena probada en cáncer de mama, colon, próstata leucemia y piel, por esta razón desidimosproponer la utilización de este péptido, pero tiene los inconvenientes que actualmente es muy costosa su obtención, como es un péptido se pierde aproximadamente 95% durante el sistema digestivo, una opción podría ser consumir soya directamente ya que es la semilla que más la contiene, pero de todas formas se encuentra en muy poca cantidad y siempre se perdería durante la digestión otro inconveniente es que el consumo de soya en el promedio mundial se muy reducido. Por estas razones proponemos clonar la secuencia de ADN de lunasina y trasformar a E. coli en un sistema de sobre expresión que nos permita obtenerla, durante el proceso de expresión de la proteína se presentaron problemas para poder obtenerla y nos dimos cuenta que el problema radica en que la proteína es demasiado pequeña de apenas 4.5 kDa, para resolver este inconveniente propusimos anclarla a la proteína DHFR con sitio de digestión para Factor Xa y de esta manera obtener a lunasina libre, los problemas que se presentaron fueron que debido que la se cuenca DHFR contiene una secuencia de 6xHis la cual le confiere carga negativa a toda la proteína en un intervalo de pH entre 6 a 7 y la secuencia de ácidos aparticos que tiene lunasina se encuentra cargado negativamente se produce un proceso de polimerización haciendo imposible la obtención de lunasina libre, por estas razones decidimos buscar un nuevo camino, el cual fue clonar a la proteína lunasin con la misma proteasa DHFR pero con un sitio de corte para la proteasa apartica la cual tiene la ventaja que su actividad se encuentra en un pH ácido y su costo que es muy económica, logramos corregir el problema de la digestión por este camino pero nos trajo nuevos inconvenientes el principal fue que digiere a la proteína de anclaje DHFR produciendo una mezcla donde es muy difícil obtener a lunasina pura, para poder resolver este problema proponemos continuar con la misma proteasa apartica debido a que no digiere a lunasina y que es muy económica , para esto sería necesario utilizar a lunasina como proteína de anclaje es decir construir una secuencia que contenga unas 3 copias de lunasina con sitios intermedios de corte para la proteasa aspártica de tal manera que al digerirla obtengamos secuencias de lunasina, el problema de la purificación que produce la secuencia de 6xHis se resolvería atreves de clonarla esta secuencia sin los 6xHis y su purificación se realizaría atreves de resina de intercambio iónico, para resolver el problema de la perdida debida a la digestión proponemos utilizar una microcapsula entérica que permita que lunasina solo sea liberada en el intestino delgado, como la digestión de las proteínas continua todavía en este sitio proponemos que lunasina se encuentre mezclada con ácido ascórbico ya que este produciría un ambiente ácido alrededor de lunasina inhibiendo a las proteasa que puedan a tacar a lunasina danto todavía mayor posibilidad de que se mantenga intacta paraqué pueda atravesar el epitelio intestinal y finalmente llegar al torrente sanguíneo otra forma en la cual se podría utilizar a lunasina es en cremas para la piel ya que se ha demostrado que reduce la probabilidad del cáncer de piel hasta en un 75% en este caso se podría micro encapsular en liposomas y con esto aumentaríamos la probabilidad de absorción.
URI : http://www.repositoriodigital.ipn.mx/handle/123456789/8096
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